Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi aberta a possibilidade de se isolar e clonar genes de bactérias, vírus, plantas e animais, e introduzi-los e expressá-los em plantas. Desta forma, a barreira do cruzamento entre espécies e até entre diferentes reinos foi rompida. A transformação genética de vegetais permite a introdução de genes específicos no genoma de cultivadores comerciais. Esta tecnologia vem auxiliar os programas de melhoramento, permitindo o fluxo de genes para plantas, os quais seriam impossíveis de serem transferidos através de cruzamentos sexuais ou fusão de genomas. As plantas obtidas no processo de transformação genética devem ser introduzidas em um programa de melhoramento para o desenvolvimento de novos cultivadores. A transformação genética de vegetais superiores tem tido avanços consideráveis nas últimas duas décadas. Vários métodos de transformação foram propostos. Atualmente, os métodos mais empregados são: o processo biobalístico, introdução de genes mediada por Agrobacterium e a eletroporação de protoplastos e tecidos. As dificuldades para obtenção de uma planta geneticamente modificada residiram na inexistência de um processo para regeneração de plantas a partir das células transformadas.
No final da década de 80, Sanford propôs o processo biobalístico como uma alternativa para introdução direta de material genético no genoma nuclear de plantas superiores. Desde então, sua universalidade de aplicações tem sido avaliada. Valendo-se de diferentes equipamentos desenvolvidos no Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia (EMBRAPA/CENARGEN), que tem demonstrado ser um processo efetivo e simples para a introdução e expressão de genes em bactérias, protozoários, fungos, tecidos vegetais e animais.
A biobalística utiliza microprojéteis de ouro ou tungstênio acelerados a altas velocidades (superiores a 1.500km/h) para carrear e introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas em células e tecidos in vivo. Todos estes sistemas baseiam-se na geração de uma onda de choque com energia suficiente para deslocar uma membrana carreadora contendo as micropartículas cobertas com o DNA. A onda de choque pode ser gerada através de uma explosão química (pólvora seca), uma descarga de gás hélio a alta pressão, pela vaporização de uma gota de água através de uma descarga elétrica com alta voltagem e baixa capacitância ou a baixa voltagem e alta capacitância. As micropartículas aceleradas penetram na parede e membrana celular de maneira não letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado. Uma das vantagens do sistema de transformação através do processo de biobalística é que este permite a introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular. Assim, foi aberta a possibilidade de transformação in situ de células do meristema apical. Entretanto, para o desenvolvimento e produção de plantas transgênicas férteis há necessidade de regeneração e produção da planta a partir das células transformadas.
Durante as últimas décadas numerosas tentativas foram feitas no sentido de se conseguir a regeneração de plantas férteis de leguminosas comercialmente importantes. Embora muitos avanços tenham sido alcançados, ainda não se obteve resultados efetivamente positivos. Os sistemas já conhecidos de obtenção de plantas transgênicas de Leguminosas baseados na transformação de células merismáticas da região apical utilizando o processo de biobalística apresentam como desvantagens a impossibilidade de seleção das células transformadas e baixa produção de plantas transgênicas. A invenção dos Profs. Elíbio Rech e Francisco Aragão permite a obtenção de plantas leguminosas transgênicas contendo DNA exógeno e que permite a seleção das células transformadas, estas últimas mantendo as características agronômicas das plantas das quais se originaram. A invenção refere-se a um processo compreendendo as etapas:
Introdução de genes exógenos em células do meristema apical dos eixos embrionários de plantas leguminosas através do método de biobalística
Indução de mutlibrotação das células na região merismática apical modificada na etapa anterior através do cultivo em um meio contendo indutor de multibrotação
Seleção das células merismáticas conforme obtidas na etapa anterior através do cultivo dos referido eixos embrionários em um meio contendo uma molécula que se concentra na região merismática apical de embriões de leguminosas
Foi surpreendentemente verificado que um processo de biobalística para a transformação de plantas leguminosas através da introdução de DNA exógeno em sua região merismática apical associada a etapas de multibrotação e de posterior seleção das plantas transformadas utilizando para tanto especificamente os eixos embrionários das referidas células possibilita a regeneração e produção de plantas transgênicas com uma frequência de produção da ordem de 1%, enquanto até então, pelos processos conhecidos esse índice era da ordem de 0,03% a 0,05%.
No processo de obtenção de plantas transgênicas de feijão, o meristema apical é bombardeado com micropartículas cobertas com o DNA. Em seguida, brotos transgênicos são regenerados a partir das células transformadas. Estes brotos são transferidos para o solo e geram sementes transgênicas. A transferência de genes para plantas é uma etapa-chave para a engenharia genética de vegetais. As micropartículas aceleradas penetram na parede e membrana celular de maneira não letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado. Uma das vantagens do sistema de transformação através do processo de biobalística é que este permite a introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular.
Uma das doenças de maior impacto na cultura do feijoeiro é o mosaico-dourado, causado por um geminivírus, o vírus do mosaico-dourado do feijoeiro (BGMV). Esta doença está hoje disseminada por todas as áreas produtoras de feijão do Brasil e em outros países da América Latina. No Brasil, em condições de campo, as perdas ficam em torno de 40 a 85%, podendo chegar a 100%, dependendo da cultivar, do estágio das plantas quando infectadas e do isolado do vírus. Ela é transmitida pela mosca-branca e basta uma única picada para que o inseto infecte a planta com o vírus. Como é preciso acabar com a mosca antes que ela pique o feijão, o controle químico acaba não sendo eficiente. Experimentos foram conduzidos em conjunto com o grupo do Dr. Josias Faria, do Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão (EMBRAPA/CNPAF), e o grupo do Prof. ElÍbio Rech na EMBRAPA/CENARGEN, com o objetivo de se obter plantas resistentes geneticamente modificadas. O projeto da Embrapa começou em 1992, tendo como objetivo a obtenção de plantas tolerantes ou imunes ao mosaico dourado do feijoeiro. Na natureza, não existem variedades que sejam imunes ao vírus. Foi preciso, então, obter um feijão transformado.
A primeira estratégia utilizada pelos pesquisadores da Embrapa para obter plantas de feijão transformadas resistentes ao vírus foi uma técnica chamada anti senso. O DNA de um gene serve de molde para a produção de RNA. RNA é a molécula mensageira que leva as informações do DNA que está protegido no núcleo para a “fábrica” de proteínas que está no citoplasma da célula. Nesse processo, só uma das fitas do DNA -que tem uma fita complementar- é copiada em RNA, sendo sempre a mesma fita para um determinado gene. Se um gene é modificado e inserido na planta de forma que a fita a ser copiada é a oposta, moléculas de RNA anti senso, com sequência complementar ao RNA normal são produzidas. Francisco Aragão, da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e um dos coordenadores da pesquisa junto com Josias Faria, introduziu inicialmente no feijão o gene modificado que estava envolvido na multiplicação do vírus. Assim, a planta passou a produzir o RNA complementar que se ligava ao RNA do vírus, impedindo que ele levasse informações à “fábrica” de proteínas, evitando a multiplicação viral. Apesar de obterem plantas que apresentavam sintomas muito fracos de infecção, os cientistas não ficaram satisfeitos com os resultados, pois queriam plantas sem vírus. Por isso decidiram tentar a estratégia que foi a responsável pela produção das plantas imunes: a transdominância letal.
Nesse método, os pesquisadores transformaram o feijão com o gene defeituoso que codifica a proteína que copia o DNA do vírus- a DNA-polimerase. A função dessa proteína é se ligar ao DNA e copiá-lo. A planta passa, então, a produzir uma proteína “preguiçosa” que se liga ao DNA do vírus, mas não o copia, tomando o lugar da proteína natural do vírus e impedindo que ela faça o seu trabalho. Com essa estratégia, foram obtidas três linhagens de plantas imunes, ou seja, sem os sintomas da doença e sem a presença do vírus. “Já estamos na terceira geração de plantas e todas elas não apresentaram sintomas”, disse Aragão. As linhagens de feijão imune já estão sendo introduzidas no programa de melhoramento convencional da Embrapa, como doadoras do gene de resistência.
Sequências do BGMV (AC1, AC2, AC3 e BC1) foram clonadas e posicionadas em anti senso e então utilizadas para obtenção de plantas transgênicas de feijoeiro. O objetivo da estratégia de anti senso é a expressão pela planta de RNAs complementares aos do vírus. Assim, estes RNAs anti senso podem-se ligar aos RNAs virais, permitindo que este RNA híbrido possa ser inativado, interrompendo o ciclo de vida do vírus. As plantas transgênicas obtidas, contendo as sequência do BGMV, foram autofecundadas durante cinco gerações e então desafiadas contra o vírus. A inoculação do vírus foi feita através de moscas-brancas virulíferas (vetor responsável pela transmissão do vírus na natureza). Algumas linhagens transgênicas não apresentaram qualquer diferença significativa nos sintomas, em relação às plantas não transgênicas.
Entretanto, duas linhagens mostraram um retardamento no aparecimento dos sintomas, e estes foram mais fracos que aqueles normalmente apresentados pelas plantas-controle. Além disso, uma quantificação através de análises de Southern blot nas plantas inoculadas mostrou que havia uma quantidade inferior de DNA viral nas plantas transgênicas. As plantas transgênicas tolerantes ao vírus estão sendo incorporadas ao programa de melhoramento da EMBRAPA/CNPAF com objetivo de introdução desta característica em diferentes cultivares e avaliação no campo. Juntamente com o grupo do Dr. Eugen Gander (EMBRAPA/CENARGEN), numa tentativa de se obter grãos de feijão contendo maiores teores de metionina, plantas transgênicas foram obtidas expressando o gene da albumina 2S de castanha-do-pará. Esta proteína possui um alto teor de metionina (18%).
Segundo Fernanda Diniz da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia o Ibama concedeu licença para que as plantas de feijão transgênico resistentes ao vírus do mosaico dourado do feijoeiro sejam testadas no campo da Embrapa Arroz e Feijão, em Goiânia, GO. Os pesquisadores Francisco Aragão (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF) e Josias Faria (Embrapa Arroz e Feijão) foram premiados pela Fundação Peter Muranyi, de São Paulo, por esse projeto. O tema da premiação esse ano era “alimentação”. Com o projeto “Obtenção de feijoeiro resistente ao vírus do mosaico dourado”. O prêmio Peter Muranyi é concedido anualmente pela Fundação a pessoas físicas ou jurídicas, ou entidades particulares e públicas, de qualquer parte do mundo, que mais tenham se destacado na descoberta ou progresso científico que beneficie o desenvolvimento e bem estar da população, especialmente no Brasil.
A cultura da soja constitui um dos principais produtos da pauta de exportações do Brasil. A introdução de tecnologias no sistema de produção de soja contribui de forma imperativa para a redução de custo para o produtor e maior poder de competividade no mercado externo. A soja é semeada em praticamente todas as regiões brasileiras sobre latitudes e altitudes variáveis, exigindo características específicas de produção, principalmente no que se refere à produtividade de grãos e à utilização de herbicidas. Diferentes espécies de plantas daninhas representam um dos maiores problemas para o agricultor que deseja cultivar uma área, são naturalmente adaptadas e possuem extrema capacidade em competir com a planta de soja. A convivência destas espécies com a lavoura gera um alto nível de competição por luz, água e nutrientes, com capacidade de causarem reduções de 42% a 90% na produção. Também pode afetar a soja de forma indireta, aumentando a umidade dos grãos, prejudicando mecanicamente as colhedoras e reduzindo o coeficiente técnico da colheita. Por ser prático e rápido, o método químico tem sido amplamente utilizado e, provavelmente, em todas as propriedades é utilizado algum tipo de herbicida.
Portanto, existe uma demanda dos produtores de soja, para a geração de plantas transgênicas tolerantes a herbicidas. Foi desenvolvido pelo Dr. Elíbio Rech, entre 1995 e 1997, uma tecnologia brasileira patenteada pela EMBRAPA, envolvendo um novo processo para modificação genética de soja e outras leguminosas, que possibilita a introdução de genes e produção de plantas transgênicas em alta frequência. Este fato, posicionou o grupo de pesquisa liderado pelo Dr. Elíbio Rech como uma referência mundial na área de desenvolvimento de plantas transgênicas. Em 1997, a EMBRAPA e a empresa BASF estabeleceram uma parceria para o desenvolvimento de variedades de soja tolerantes a herbicidas da família das imidazolinonas. Utilizando tecnologia proprietária, foram desenvolvidos vários eventos de plantas transgênicas de soja que apresentaram tolerância ao herbicida, após a pulverização com a dosagem utilizada comercialmente. Os eventos produzidos foram avaliados em conjunto com o grupo de pesquisadores da EMBRAPA Soja, visando à seleção de um evento elite. Foi produzido um evento elite, que está integrado junto ao programa de melhoramento genético da EMBRAPA Soja.
Atualmente, o projeto se encontra nas fases finais, que envolvem a introgressão da tolerância a herbicidas, para as variedades adaptadas às diferentes regiões, estudos de segurança alimentar e ambiental e com a previsão de iniciar a comercialização no ano de 2009-2010 (informação confidencial da EMBRAPA/BASF).Este trabalho representará a produção da primeira planta manipulada geneticamente utilizando a tecnologia do DNA recombinante no Brasil que chegará ao mercado. Um dos únicos exemplos a nível mundial, na geração de uma comodite advinda da tecnologia do DNA recombinante, através da parceria publico-privada. Fato que demonstra a competência nacional e a possibilidade de desenvolvimento de um produto com alta tecnologia. A nível nacional, o produto desenvolvido permitirá à EMBRAPA manter a competividade na geração de novas cultivares de soja, frente aos produtos desenvolvidos pelas grandes empresas transnacionais. Em adição, o impacto da soja transgênica desenvolvida transporá as fronteiras do país e possibilitará utilização da planta de soja como vetor para introgressão da característica introduzida em variedades adaptadas, em países como os Estados Unidos, China e outros, com significativos impactos econômicos para o Brasil. O motivo principal da Embrapa para se envolver em tal projeto sempre foi providenciar, para a sojicultura brasileira, uma alternativa para a resistência ao herbicida glifosato, para que o agricultor não se visse obrigado a utilizar um só herbicida nas suas culturas.
Além dessa preocupação, a Embrapa sempre se viu na responsabilidade de ter alternativas estratégicas em relação às plantas transgênicas tolerantes ao herbicida glifosato. Os recursos humanos e a infraestrutura montadas para desenvolver esse projeto propiciaram à Embrapa ter sua PRIMEIRA patente de processo biotecnológico. É importante mencionar que a patente da Du Pont referente à utilização da biobalística para a produção de soja transgênica, terminará no ano 2010.
Fonte:
http://www.biotecnologia.com.br/bio/5_i.htm
http://www.brasil.terravista.pt/Ipanema/3888/transembrapafeijao.htm
Patentes: Onde o Brasil perde, Sindicato da indústria de Artefatos de papel, Papelão e Cortiça no Estado de São Paulo, dez/93, pg 7
acesso em abril de 2002
“Fundação Peter Murányi premia pesquisadores que desenvolveram feijão resistente ao mosaico dourado” Autor: Mauricio Cardoso Repórter da Agência Brasil Fonte:Agência Brasil 13/4/2004
Agradeço ao prof. Elibio Rech (rech@cenargen.embrapa.br) pela sua foto fornecida para o site em novembro de 2003 e a Fernanda Diniz (fernanda@cenargen.embrapa.br) por informações cedidas em abril de 2004 para composição desta página
Agradeço ao INPI/FINEP pelo envio de informações em junho de 2008 para composição desta página
